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常用的半抗原與蛋白偶聯方法簡介

更新時間:2016-06-17 15:47:12點擊次數:1374次
  常用的半抗原與蛋白偶聯方法簡介
———文章轉自zjubell, 發表在丁香園免疫學技術論壇。
(一)分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶聯)
1、混合酸酐法,也稱氯甲酸異丁酯法(isobutyl chloroformate method)
偶聯時,半抗原分子中的羧基可與氯甲酸異丁酯在有機溶劑中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后與蛋白分子中的氨基形成肽鍵。
氨甲喋呤(MIT)與β-半乳糖苷酶偶聯的混合酐法
1、5.8mg MIT用0.1ml二甲基甲酰胺溶解,冷卻至10度,加2ul氯甲酸異丁酯,10度攪拌反應30分鐘。
2、1.5mg酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。
3、10度反應4小時(必要時加NaOH,以維持溶液的pH為9.0,q然后4度過夜。
4、過sephadex G-25層析柱,柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巰基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸緩沖液(pH7.5)平衡和洗脫,合并含酶的洗脫管內液體,進一步純化后,保存于含BSA 0.1%(w/v)、NaN3 0.02%(w/v)的緩沖液中。
2、碳化二亞胺法制備3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血藍蛋白免疫原的操作步驟
1、  取EDC 100mg , 用pH8.0的10 m mol/L PBS液2.5ml使之充分溶解(I液)
2、  取3,3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用0.2mol/L NaOH 溶液2ml 溶解(II液)
3、  取血藍蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS (pH8.0)液中(III液)
4、  將II液與III液混合,在磁力攪拌下逐滴加入I液(余下0.5ml)
5、  室溫下避光攪拌1小時,逐滴加入余下的I液
6、  4度攪拌12小時
7、  靜置10小時(4度)
8、  有蒸餾水使之充分透析(約48小時),得免疫原。
3、孕酮與與β-半乳糖苷酶偶聯的N-羥琥珀酰亞胺酯法
1、  用二堊烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯,配成濃度為100m mol/L的溶液。
2、  加羥琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和 DCC(二環已基碳化二亞胺),200 m mol/L, 4度反應16小時。
3、  用簿層掃描方法純化(氯仿:水=9:1)
4、  按孕酮/酶摩爾濃度比約為10的比例,將上述溶液加入到酶液(用pH7.4,濃度50 m mol/L的磷酸緩沖液溶解)中。
5、
(二)含有氨基或可還原硝基半抗原的偶聯
1、芳香胺類半抗原與蛋白質重氮化偶聯的操作步驟
1、  用0.1 mol/L HCl溶液配制 4 m mol/L濃度的半抗原。
2、  滴加1%NaNO2(過量),4度持續攪拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物試紙或在白色磁磚上加1%淀粉和50m mol/L KI進行監控。游離亞硝酸可將氧化物氧化成碘,碘再與淀粉反應變成藍黑色。
3、  溶液變成藍黑色后,繼續反應15分鐘。
4、  用pH9.0、濃度為200m mol/L的硼酸或碳酸緩沖液溶解蛋白。
5、  邊攪拌,邊加入重氮化的半抗原(防止局部發生酸過量現象),調節pH到9.5。
6、  冰箱中攪拌反應2小時,不斷調節pH到9.0。
7、  用PBS透析2天
8、  -20度保存(濃度為20mg/mL)
雙功能的酰亞胺酯(imidate esters)可以氨基反應,形成脒。例如:用二甲基已二酰亞胺酯(dimethyladipimide)將去甲基三正喋呤(desmethylmortriptyline)與β-半乳糖苷酶偶聯。
2、、應用雙功能酰亞胺酯(imidate esters)制備去甲基三正喋呤-與β-半乳糖苷酶標記特的操作步驟
1、  用含5%(W/V)N-乙基嗎啉的無水甲醇0.4ml,在室溫下溶解570ug去甲基三正喋呤和488ug 二甲基已二酰亞胺酯(dimethyladipimide)(A液)
2、  取與β-半乳糖苷酶 100 ug, 溶于pH9.9的100 m mol/L碳酸緩沖液(含MgCl2 10m mol/L,2-巰基乙醇 10 m mol/L 0.1ml(B液)
3、  將A液倒入B液。
4、  20度反應90分鐘后,加含NaCl 100 m mol/L, MgCl2 10 m mol/L和2-巰基乙醇 10 m mol/L、pH7.5的Tris-醋酸緩沖液(50m mol/L) 1ml, 終止反應。
5、  過sephadex G-25, 去除小分子物質,得酶標記物(約75%的酶與半抗原結合,但用三正喋呤代替去甲三正喋呤(demethylmortriptyline )進行偶聯,則只有15%的酶與之結合。
(三)含巰基半抗原的偶聯
可用馬來酰亞胺方法與蛋白偶聯。此外,將載體蛋白用溴乙酰胺(bromoacetamide)激活。或將載體蛋白與半抗原在pH4.0的醋酸緩沖液中,通過過氧化氫的作用形成二硫鍵,也可以將半抗原連接到蛋白質分子上。
(四)含羥基的半抗原偶聯
醇類羥基通過形成半琥珀酸酯轉化為羧基的操作步驟
1、  15g 2,2,2-三氯乙醇(2,2,2-trichloroethanol),12g 琥珀酸酐(succinic anhydride)和8.7ml 三乙基胺(triethylamime)用100 ml乙酰乙酯溶解。
2、  加熱回流1小時。
3、  減壓蒸餾去溶劑,,殘余物用5% NaHCO3水溶液溶解。
4、  用乙醚洗滌兩次,然后用H2SO4進行s酸化(pH到2.0).
5、  用水洗滌固形物(為三氯乙基半琥珀酸酯)兩次,用氯仿-已烷使其結晶(產量約75%,熔點88-89度)
6、  取2.5g 半琥珀酸酯溶于6.5ml 亞硫酰氯(thionyl chloride)中,65度加熱30分鐘。
7、  減壓蒸發,干燥1小時(高度真空條件下)。
8、  將上述產生(2,2,2-三氯憶基琥珀酰氯)溶于15ml N,N-二甲基-乙酸乙酰胺(N,N-dimethylethylacetamide)中,室溫攪拌反應2小時。
9、  65度真空蒸發后,用異丙醇使結晶析出來(得鹽酸化的結晶---5`-酯約84%,熔點160度)。
10、用溶于二甲基甲酰胺中的鋅和醋酸解離三氯乙酯,得f半抗原-半琥珀酸酯,這樣引和的羧基可與蛋白質偶聯(如用碳化二亞胺化)。
半抗原用NaIO4氧化其中的糖苷醇后再與蛋白質偶聯的操作步驟
1、  20mg 腺苷溶于1ml 100m mol/L NaIO4溶液中,4度避光反應30分鐘。
2、  加1滴乙二醇(得A液)
3、  將A液加入到β-半乳糖苷酶液(20mg/ml,用150m mol/L NaCl,10m mol/L MgCl2水溶液溶解,用3%K2CO3調節pH至9.0)中
4、  4度反應2小時,期間不斷調節pH9.0
5、  加入臨時配制的50 mg/ml NaBO4溶液,用量為反應體積的1/10。 4度反應過夜。
6、  用含有MgCl2 10m mol/L,2-巰基乙醇 10 m mol/L、 NaCl 100 m mol/L的50 m mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)透析(更換透析液數次)
(五)含酮基或酮基半抗原的偶聯
是將酮基經羥胺類化合物處理變成肟類化合物,再進一步將肟類化合物中的羥基,衍變成羧基化合物,再進一步進行含羧基半抗原的偶聯操作。這類羥胺類化合物主要有:氨氧乙酸aminoxy acetic acid 或羧甲氧胺carboxymethoxyl amine 或者鹽酸羥胺
酮基的類固醇分子中引入羧基的操作步驟
1、  在200ml 乙醇中,加入O-(羧甲基)羥胺 (O-(carboxyl)hydroxylamine)和酮基半抗原,使其濃度分別為10m mol/L 和4m mol/L
2、  加熱回流90分鐘
3、  旋轉蒸發,減少容積,然后加水至40ml,用乙醚抽提
4、  用水洗滌乙醚抽提物,用Na2SO4干燥成白色粉末。
(六)、其他半抗原的偶聯
雖含有游離基團,但因這些基團對于維其生物活性十分重要,因些不能直接用來與載體蛋白 偶聯。
制備雌二醇-6-肟的操作步驟
a、  雌二醇二醋酸鹽的制備
1、  1g雌二醇溶于14ml 吡啶及3.5ml 醋酐中
2、  加熱回流1小時,冷卻后傾入冰水中。
3、  收集白色晶體,得產物約1.1g(熔點126到127度)
b、  雌二醇-6-酮-二醋酸鹽的制備
4、雌二醇二醋酸鹽1.1g,滴加冰醋酸3.8ml 溶解后加含0.93g CrO3的含水冰醋酸6.35ml (H2O:Hac=0.75:5.6)
5、室溫攪拌1小時,靜置24小時
6、用水稀釋,用乙醚提取4次
7、用蒸餾水洗2次
8、減壓蒸餾,得結晶油狀渣物。
9、用90度烘干20分鐘,得粗制品約500mg
10、用11ml 無水乙醇溶解粗制品,再加1.1ml 冰醋酸及1.5g吉納你特T試劑(Girad T),回流1小時。
11、冷卻后,用冰致冷的蒸餾水稀釋,用2.5mol/LNaOH調節pH至6.0-6.2.
12、用乙醚抽提3次,棄去乙醚。
13、水層用濃鹽酸酸化(鹽酸終濃度為1mol/L).
14、室溫靜置2小時。
15、用乙醚抽提3次。
16、合并乙醚抽提液,用0.125mol/L碳酸鈉溶液洗1次,用蒸餾水洗3次。
17、用無水硫酸鈉脫水,蒸干。
18、加7ml 醋酐,回流20分鐘。
19、冷卻后傾入用冰致冷的蒸餾水中,然后過濾、干燥得產物約176mg (熔點為162-166度)
c、  二醇-6-酮的制備
20、用5.5ml 20%的氫氧化鉀-甲醇溶液(W/V)溶解雌二醇-6-酮-二醋酸鹽(176mg),在室溫下于氮氣中水解24小時。
21、加蒸餾水稀釋,用乙醚抽提3次。
22、在乙醚提取液中無水硫酸鈉進行脫水,蒸發干燥,得產物約60mg(熔點為278-282度)
d、  雌二醇-6-肟的制備
23、取雌二醇-6-酮 50mg ,鹽酸羧甲基羧胺50mg,溶于20%含水甲醇(V/V)7ml 和1mol/L醋酸鈉4ml中,回流1.5小時。
24、減壓、蒸餾、濃縮后,加蒸餾水20ml
25、用2 mol/L NaOH調節pH至8.5。
26、用醋酸乙酯抽提4次
27、水層用1 mol/L鹽酸酸化至pH2.5。
28、用醋酸乙酯抽提4次
29、合并抽提液,蒸干,得產物約100mg(結晶熔點約186-188度)
其他半抗原如:青霉素、生物素、地高辛、熒光素等半抗原交聯。
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