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對類風濕因子具有高反應活性的熱聚IgG的制備

更新時間:2016-06-17 15:47:52點擊次數:1167次
摘要:目的:優化熱聚IgG的制備條件,提高對RF的檢測靈敏度。方法:利用高效液相凝膠色譜和酶聯免疫吸附技術研究加熱條件對熱聚IgG分子量分布及其對類風濕因子結合能力的影響。結果:將IgG溶液(10mg/ml)62℃熱聚30min,其優勢聚合度為11左右,此時它對類風濕因子的結合能力最強。結論:應用高效液相凝膠色譜與ELISA技術,對熱聚IgG體系進行分離測定和活性分析,縮短了測定時間,提高了結果的靈敏度和準確性。

熱聚IgG是在一定溫度條件下由IgG自身聚合而成的多聚體,它具有同類風濕因子(RheumatoidfactorsRF)反應的特性,常用于血清中RF的檢測。IgG的熱聚條件直接影響產物的結構及其生物反應活性。本文旨在利用高效液相凝膠色譜和酶聯免疫吸附技術研究熱聚條件對產物分子量分布及其對RF結合能力的影響,優化制備條件,提高對RF檢測的靈敏度。

1、材料與方法

1.1 材料γ球蛋白注射液由中國醫學科學院血液病研究所購得;RF-ELISA試劑盒由南京軍區總醫院購得;陽性類風濕血清由天津市第三中心醫院提供。

1.2 方法

1.2.1 IgG的提純根據Flodint的方法,利用SephadexG-200柱從γ球蛋白中提純IgG

1.2.2 熱聚IgG的制備將IgG溶液(10mg/ml)置一定溫度的恒溫水浴中保溫一定時間,冰水冷卻。

1.2.3 聚合度的測定利用校正的TSKG-4000HPLC色譜柱測定聚合物的分子量,計算聚合度。

1.2.4 RF結合能力的測定取熱聚IgG溶液(2mg/ml)0.2ml,加入0.3ml類風濕血清和0.2ml生理鹽水,混勻,室溫反應1h后轉入4℃冰箱過夜。用ELISA試劑盒測定反應前后體系中3RF的濃度,計算RF被結合的量。

2、結果

2.1 熱聚溫度的確定在聚合時間確定為30min的條件下,IgG的熱聚發生在6064℃這樣一個較窄的溫度區間內。隨著熱聚溫度的提高,聚合反應的程度加大,產物聚合度增加,對RF的結合能力增強。當熱聚溫度為62℃時,優勢聚合度達11左右,對RF的結合能力最強。

2.2 熱聚時間的確定在聚合溫度確定為62℃的條件下,熱聚30min的產物對RF的結合能力最強。繼續延長加熱時間,產物聚合度的增加,但對RF結合能力開始下降。當加熱時間達120min時,優勢聚合度達22,聚合體系變成凝膠狀,ELISA法無法測定其反應活性。

綜上,對類風濕因子具有高結合能力的熱聚IgG的制備條件是,將IgG溶液(10mg/ml)62℃下加熱30min。在該條件下,產物對IgMRFIgGRFIgARF的結合量分別達802615247U/mgIgG

3、討論

3.1 熱聚IgG實際上是由一系列不同聚合度的分子組成的混合物,其最高分子量可達107D。該體系分子量分布的測定可采用光散射、葡萄糖密度梯度離心、常壓凝膠層析等方法。其中光散射法只能給出體系的平均分子量;密度梯度離心法僅能分段給出部分聚合物的平均分子量;常壓凝膠層析雖可獲得較滿意的結果,但樣品用量大且耗時過長。鑒于上述方法的不足,本文采用裝有TSK-G-4000柱的HPLC,不僅使分離測定的時間大大縮短,而且提高了分辨率。本文采用ELISA法評價了熱聚IgGRF的結合能力,較經典的免疫沉淀、免疫抑制及濁度分析相比,提高了靈敏度,而且可以分別檢測出它對IgMRFIgGRFIgARF的結合能力,結果更為準確和全面。

3.2 RF因子是存在于類風濕關節炎患者血漿中的一類以自身變性IgG為靶細胞的抗體,能夠與IgG分子Fc段上的抗原決定簇反應。熱聚過程中,IgG發生構象改變,活性位點的數目和可及性提高,與RF的結合能力增強,并在某一條件下達到最大值。繼續強化熱聚條件,產物的反應活性開始下降。這可能因為聚合度的進一步增大降低了反應位點的可及性,或是劇烈的變性條件造成了原有活性位點的破壞。

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